雙熒光素酶報告基因的檢測

近年來,非編碼RNA(Non-coding RNA)的研究成為熱點,特別是microRNA的研究。當發現一個新的miRNA,并研究其是否對相關疾病具有調控作用時,就需先對它和靶基因的調控關系做一驗證,而目前常用的靶向關系的驗證方法就是:雙熒光素酶報告基因檢測。本文就相關檢測原理、螢火蟲熒光素酶、海腎螢光素酶、報告基因、檢測步驟、細胞裂解及Luciferase檢測作簡單介紹。

檢測原理

由于miRNA主要是通過作用于靶基因的3'UTR區域,這樣就可以將目的基因3'UTR區域構建至含有報告基因螢光素酶的載體上,通過比較miRNA mimics或miRNA inhibitor作用后報告基因表達的改變(監測螢光素酶的活性變化)可以定量反映出miRNA對目的基因的抑制作用。結合定點突變等方法還可以進一步確定miRNA與靶基因3'UTR的作用位點。

螢火蟲螢光素酶

螢火蟲熒光素是從甲蟲(Photinus pyralis)中分離得到,分子量為61kDa的蛋白,在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下,可以催化熒光素(luciferin)氧化成氧化熒光素(oxyluciferin),在luciferin氧化的過程中,會發出生物螢光(bioluminescence)。螢火蟲螢光素酶催化luciferin發光的z強發光波長為560nm。

海腎螢光素酶

海腎(Renilla)熒光素酶則是從海腎(Renilla reniformis)中分離,分子量為36kDa的蛋白,在氧氣存在的條件下,可以催化腔腸素(coelenterazine)發生氧化,在coelenterazine氧化的過程中也會發出生物螢光(bioluminescence)。海腎螢光素酶催化coelenterazine發光的z強發光波長為465nm。

生物螢光可以通過熒光酶標儀進行測定,從而對實驗結果進行定量。

報告基因

報告基因(report gene)是指一組編碼易被檢測的蛋白質或酶的基因,可通過報告基因產物的表達來“報告”目的基因的表達調控。

檢測步驟

常規培養細胞后進行細胞轉染:

(1)轉染前一天將細胞計數,取2mL加入6孔板中,使得孔板的細胞密度不低于5*105個;

(2)對于每孔細胞,用250uL的無血清培養基稀釋2μg DNA(質粒),室溫孵育5min;

(3)對于每孔細胞,用250uL的無血清培養基稀釋5uL Lipo2000,室溫孵育5min;

(4) 將2和3中的液體混合,室溫孵育20min;

(5) 將預先分好的貼壁細胞換成無血清培養基,加入上述復合物,在37℃,5%的CO2中培養6h,再換成完全培養基,繼續在37℃,5%的CO2中培養,72h檢測轉染水平。

細胞裂解及Luciferase檢測

RLU值的計算:在以海腎螢光素酶為內參的情況下,用螢火蟲螢光素酶測定得到的RLU1值除以海腎螢光素酶測定得到的RLU2值。根據得到的比值來比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。如果以螢火蟲螢光素酶為內參,也可以進行類似計算。