Transwell細胞遷移實驗介紹

細胞遷移與侵襲實驗將 Transwell 小室放入培養板中,小室內稱上室,培養板內稱下室,上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔,將研究的細胞種在上室內,由于聚碳酸酯膜有通透性,下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞,應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜,就可以進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。

實驗步驟

一、材料準備

可拍照顯微鏡,Transwell小室,孔徑8μm,沒包被膠的(Coster和Corning公司的也較常用),Transwell遷移實驗的細胞培養板24孔板。細胞培養板應當與購買的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,無血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培養基,DMEM完全培養基,1640完全培養基(也可加到20%血清),無菌PBS,棉簽,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,結晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS結晶紫)

二、步驟和流程

2.1基質膠鋪板

用BD公司的Matrigel 1:8(根據細胞產生mmp的量來決定)稀釋,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進行基底膜水化。

2.2制備細胞懸液

①制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12-24h,進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。

②消化細胞,終止消化后離心棄去培養液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的無血清培養基重懸。調整細胞密度至5×105/ml。

2.3接種細胞

①取細胞懸液100μl加入Transwell小室。

② 24孔板下室一般加入600μl含20S的培養基,特別注意的是,下層培養液和小室間常會有氣泡產生,一旦產生氣泡,下層培養液的趨化作用就減弱甚至消失了,在種板的時候要特別留心,一旦出現氣泡,要將小室提起,去除氣泡,再將小室放進培養板。

③培養細胞:常規培養12-48h(主要依癌細胞侵襲能力而定)。24h較常見,時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外,處理因素對細胞數目的影響也不可忽視。

2.4結果統計

直接計數法,“貼壁”細胞計數,這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后,可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里面去,通過給細胞染色,可在鏡下計數細胞。

取出Transwell小室,棄去孔中培養液,用無鈣的PBS洗2遍,甲醇固定30分鐘,將小室適當風干。

0.1%結晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞,用PBS洗3遍。

400倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細胞,記數。