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慢病毒(Lentivirus)載體是以 HIV-1 (人類免疫缺陷1型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體。具有感染譜廣泛、可以有效感染分裂期和靜止期細胞、長期穩定表達外源基因等優點,因此成為導入外源基因的有力工具?，F在慢病毒系統已經被廣泛應用到各種細胞系的基因過表達、RNA干擾、microRNA研究以及活體動物實驗中。
整體實驗流程
實驗流程(1、2、3為并列步驟)
1. 慢病毒過表達質粒載體的構建 設計上下游特異性擴增引物,同時引入酶切位點,采用PCR技術(采用高保真KOD酶,3K內突變率為0%)從模板中(cDNA質?；蛘呶膸?調取目的基因CDS區(coding sequence)連入T載體。將CDS區從T載體上切下,裝入慢病毒過表達質粒載體。
2. 慢病毒干擾質粒載體的構建 合成siRNA對應的DNA頸環結構,退火后連入慢病毒干擾質粒載體。
3. miRNA載體構建從 Genomic 中調取基因相應的Mir 前體, 并在調取引物中引入酶切位點。
4. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化 制備慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒(兩質粒包裝系統),三種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提,共轉染293T細胞,轉染后6 h 更換為完全培養基,培養48和72h后,分別收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液,病毒上清液通過超離心濃縮病毒。
