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Western Blot
簡介:
蛋白質印跡的發明者一般認為是美國斯坦福大學的喬治·斯塔克(George Stark)。在尼爾·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化學》(Analytical Biochemistry)中首次被稱為Western Blot。蛋白免疫印跡( Western Blot) 是將電泳分離后的細胞或組織總蛋白質從凝膠轉移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上,然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質檢測技術,現己廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。
原理:
與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似,但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗。經過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。
Western Blot顯色的方法主要有以下幾種:
i. 放射自顯影
ii. 底物化學發光ECL
iii. 底物熒光ECF
iv. 底物DAB呈色
現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色,體同水平和實驗條件的是用第①種方法,發表文章通常是用底物化學發光ECL。只要買現成的試劑盒就行,操作也比較簡單,原理如下(二抗用HRP標記):反應底物為過氧化物+魯米諾,如遇到HRP,即發光,可使膠片曝光,就可洗出條帶。
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