透射電鏡實驗技術

1、透射電子顯微鏡結構和成像原理

透射電子顯微鏡結構包括兩大部分:主體部分為照明系統、成像系統和觀察照相室;輔助部分為真空系統和電氣系統。

2、透射電鏡的應用

透射電子顯微鏡在材料科學、生物學上應用較多。由于電子易散射或被物體吸收,故穿透力低,樣品的密度、厚度等都會影響到成像質量,必須制備更薄的超薄切片,通常為50～100nm。所以用透射電子顯微鏡觀察時的樣品需要處理得很薄。

3、常用的方法

超薄切片法、冷凍超薄切片法、冷凍蝕刻法、冷凍斷裂法等。對于液體樣品,通常是掛預處理過的銅網上進行觀察。

4、樣本制備方法

由于電鏡電子束穿透能力的限制,必須把標本切成厚度小于0.1um以下的薄片才適用,這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。

在透射電鏡的樣品制備方法中,超薄切片技術是基本、常用的制備技術。超薄切片的制作過程基本上和石蠟切片相似,需要經過取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。

一. 取材

基本要求組織從生物活體取下以后,如果不立即進行適當處理,會由于細胞內部各種酶的作用,出現細胞自溶現象。此外,還可能由于污染,微生物在組織內繁殖使細胞的微細結構遭受破壞。因此,為了使細胞結構盡可能保持生前狀態,必須做到快、小、準、冷:

(1).動作迅速,組織從活體取下后應在z短時間內 (爭取在1分鐘內) 投入2.5%戊二醛固定液。

(2).所取組織的體積要小,一般不超過1mm×1mm×1mm。也可將組織修成1mm×1mm×2mm大小長條形。因為固定劑的滲透能力較弱,組織塊如果太大,塊的內部將不能得到良好的固定。

(3).機械損傷要小,解剖器械應鋒利,操作宜輕,避免牽拉、挫傷與擠壓。

(4).操作z在低溫(0℃～4℃)下進行,以降低酶的活性,防止細胞自溶。

(5).取材部位要準確。取材方法:將取出的組織放在潔凈的蠟版上,滴一滴預冷的固定液,用兩片新的、鋒利的刀片成“拉鋸式”將組織切下并修小,然后用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果組織帶有較多的血液和組織液,應先用固定液洗幾遍,然后再切成小塊固定。

二.固定

固定的目的是盡可能使細胞中的各種細胞器以及大分子結構保持生活狀態,并且牢固地固定在它們原來所在的位置上。固定的方法有物理的和化學的兩大類。物理的方法系采用冰凍、干燥等手段來保持細胞結構;化學的方法是用一定的化學試劑來固定細胞結構?，F通常使用化學方法對組織或細胞進行固定。

常用固定劑

1、四氧化鋨 (osmium tetroxide,)是一種強氧化劑,與氮原子有較強的親和力,因而對于細胞結構中的蛋白質成分有良好的固定作用。它還能與不飽和脂肪酸反應使脂肪得以固定。此外,四氧化鋨還能固定脂蛋白,使生物膜結構的主要成分磷脂蛋白穩定。它還能與變性DNA以及核蛋白反應,但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化鋨固定劑有強烈的電子染色作用,用它固定的樣品圖象反差較好。鋨固定的時間一般為1-2小時。

2.戊二醛 (glutaraldehyde C5H8O2),戊二醛的優點是對糖原、糖蛋白、微管、內質網和細胞基質等有較好的固定作用,對組織和細胞的穿透力比四氧化鋨強,還能保存某些酶的活力,長時間的固定(幾周甚至1～2個月)不會使組織變脆。

缺點是不能保存脂肪,沒有電子染色作用,對細胞膜的顯示較差。

組織塊固定常規采用戊二醛—鋨酸雙重固定法。分預固定和后固定,中間用磷酸緩沖液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小時以上、后固定用1%鋨酸固定液固定1～2小時,pH7.3～7.4。

固定完畢,用緩沖液漂洗20分鐘后進行脫水。

細胞內部結構冷凍割斷法

1.取材和固定:為了使細胞結構清晰,不被過多的血細胞污染,可在取材前用灌注法沖洗。即先將動物麻醉,經腹主動脈注入生理鹽水或低分子量的右,切開下腔靜脈放血,至無血色為止。然后迅速取材,將樣品修成1mm×1mm×5mm大小,投入1%鋨酸溶液中固定1小時,用1/15M磷酸緩沖液 (pH7.4)清洗兩次,每次10分鐘。

2.二甲基亞 浸泡:將樣品依次放入25%、50%二甲基亞砜溶液中,各浸泡30分鐘。

3.割斷:用TF—1型冷凍割斷裝置進行割斷。然后將割斷后的樣品放到50%二甲基亞砜中,等融化后再用1/15M磷酸緩沖液浸洗,每次10分鐘,換液5次。

4.軟化及后固定:將樣品放入0.1%鋨酸中軟化,溫度20(C,時間48～72小時。然后用1% 八 固定1小時,雙蒸水浸洗1小時,換液幾次,需徹底清洗干凈。

5.導電染色:將樣品放入2%丹寧酸中2小時(或過夜),以雙蒸水清洗1小時,換液幾次。再以1% 八 固定30～60分鐘,雙蒸水清洗1小時。

6.脫水、干燥及鍍膜:按常規方法進行。

掃描電鏡技術服務

1、掃描電鏡成象原理

掃描電鏡主要用二次電子觀察形貌,在掃描電鏡中,電子槍發射出來的電子束,經三個電磁透鏡聚焦后,成直徑為幾個納米的電子束。末級透鏡上部的掃描線圈能使電子束在試樣表面上做光柵狀掃描。試樣在電子束作用下,激發出各種信號,信號的強度取決于試樣表面的形貌、受激區域的成分和晶體取向。設在試樣附近的探測器把激發出的電子信號接受下來,經信號處理放大系統后,輸送到顯象管柵極以調制顯象管的亮度。由于顯象管中的電子束和鏡筒中的電子束是同步掃描的,顯象管上各點的亮度是由試樣上各點激發出的電子信號強度來調制的,即由試樣表面上任一點所收集來的信號強度與顯象管屏上相應點亮度之間是一一對應的。因此,試樣各點狀態不同,顯象管各點相應的亮度也必不同,由此得到的象一定是試樣狀態的反映。放置在試樣斜上方的波譜儀和能譜儀是用來收集X射線,借以實現X射線微區成分分析的。值得強調的是,入射電子束在試樣表面上是逐點掃描的,象是逐點記錄的,因此試樣各點所激發出來的各種信號都可選錄出來,并可同時在相鄰的幾個顯象管上顯示出來,這給試樣綜合分析帶來極大的方便。

2、掃描電鏡取材要求

由于電鏡電子束穿透能力的限制,必須把標本切成厚度小于0.1um以下的薄片才適用,這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。 在透射電鏡的樣品制備方法中,超薄切片技術是z基本、z常用的制備技術。超薄切片的制作過程基本上和石蠟切片相似,需要經過取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。

提示

透射電鏡標本先應用超薄切片機(Ultrotome)進行切片,再經戊二醛和餓酸雙重固定,丙酮脫水,環氧樹脂包埋,超薄切片,醋酸枸椽酸電子又重染色,透射電鏡觀察。

掃描電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定,乙醇逐級脫水,CO2臨界點干燥,真空噴金,掃描電鏡觀察。